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      医用臭氧联合关节镜对膝关节骨关节炎滑膜IL1R I、CXCL13与IL24的影响

      发布时间:2021-07-23作者:来源:洛阳欧立方医疗器械有限公司点击:180

       

      医用臭氧联合关节镜对膝关节骨关节炎滑膜IL1R ICXCL13IL24的影响

       

                      付纳新马超孙劲黄晖赵伟孟桢桢田莉刘朝奇

       

            目的:观察医用臭氧对膝关节骨关节炎滑膜组织IL1R ICXCL13 IL24的影响。方法: 65(失访11)膝关节骨关节炎患者,随机分为臭氧联合关节镜治疗组和单纯关节镜治疗组,每组27例,分别于***-次手术及6 个月后的第二次手术中切取患者膝关节增生滑膜组织,其中臭氧联合关节镜治疗组关节镜手术后关节腔内注射40 u g/mL浓度医用臭氧40mL/周,共2;单纯关节镜治疗组术后不注射臭氧,采用反转录PCR法、蛋白印迹法比较两组滑膜治疗前后L1R 1CXCL13IL24基因和蛋白表达的差异。结果:与单纯关节镜治疗组相比,医用臭氧联合关节镜治疗组术后滑膜组织儿1R I 的表达量降低有显著统计学意义(P< 0.01) ; CXCL13的表达量较单纯关节镜治疗组升高有显著统计学意义(P<0.01) ; IL24 mRNA和蛋白质表达量较关节镜组升高有统计学意义(P<0.05)。结论:医用臭氧能通过影响L1R 1CXCL13IL 24的表达减轻关节炎症状,延缓滑膜炎的进展,医用臭氧联合关节镜治疗骨关节炎较单纯关节镜清理术临床效果更好,但不能完全阻止和逆转骨关节炎病程进展。

       

            骨关节炎(osteoarthritis, OA)是一种临床多发病,患者关节软骨出现不同程度的退变,伴随滑膜炎症、产重影响生存质量。研究表明IL1RICx-CL131L24 等参与骨关节炎的病程。医用臭氧有强大的氧化能力和抗炎作用,在骨关节炎和腰椎间盘出症的治疗中取得了肯定的疗效,关节镜以其微创优势取得广泛认可, 目前关节镜联合臭氧治疗骨关节炎的临床研究鲜有报道,本研究联合利用这两种治疗方式,通过对术后际关节滑膜组织I1R1CXCL13IL24 表达的结果对比分析,为临床治疗提供依据。

       

            1资料与方法

       

            1.1 -般资料201312月至20156月在我院接受手术治疗的膝关节骨关节炎患者,病程3~ 15年,共65(失访11) 60膝,手术均由同- -组医师完成。所有实验内容经三峡大学第三临床医学院葛洲坝集团中心医院***委员会批准,所有患者已签订知情同意书及二次手术协议。根据随机数字表法将所有患者分为臭氧联合关节镜组( A)和单纯关节镜组(B) ;其中A27(29),男17( 18),女10(11); B27(31),男13( 16),女14(15)

       

            1.2纳入与排除标准纳入标准: ( 1 )美国风湿病学会( ACR)推荐的KOA诊断标准及符合Kell-gren X线分级标准| ~ II级的患者; (2) 无医用臭氧和关节镜下清理术治疗的禁忌证患者( 如蚕豆病) ; (3) 病情稳定,1个月内未采用其他方式治疗或服用激素类药物。排除标准( 1)严重的高血压、心脏病、糖尿病及肝、肾功能不全者; (2)膝关节骨折、肿瘤、类风湿、痛风、结核及化脓性感染者;(3)关节内有游离体或半月板损伤者; (4) 关节强直者:(5)患有黑色素瘤、类风湿关节炎、银屑病、强制性脊柱炎、系统性红斑狼疮者; (6) Kellgren X线分级标准为IV级的患者。

       

            1.3治疗方法A组行常规膝关节镜检清理术后留置冲洗

       

      管接生理盐水冲洗2 ~ 3 d。术后2周拆线后予医用臭氧关节腔内注射,每周1次,共2次  , 操作方法为:连接医用氧气瓶与医用臭氧臭氧发生器,氧气输出量为4 L/min,臭氧输出浓度40 μ g/mL;患者屈膝仰卧,消毒铺巾后取髌骨前外侧下方入路膝关节腔穿刺,注入40 mL经滤器过滤的医用臭氧,拔出针头后活动膝关节,患者休息10 minB组行常规膝关节镜检加清理术后留置冲洗管接生理盐水冲洗2 ~ 3d。两组患者治疗期间均需指导患者行正确的功能锻炼[5]

       

            1.4取材术中切取患者膝关节增生的滑膜,一部分经林格液冲洗后多聚甲醛(PF)固定用于免疫组化( IHC)检测,其余部分于液氮罐中迅速冷冻30 min后转入-80C冰箱保存待检。治疗6个月后再次行膝关节穿刺和膝关节镜检加清理术获取关节液及滑膜标本,同样方法处理后待检。

       

            1.5观察指标

       

            1.5.1IL1R|mRNA表达的检测在低温下称取适量滑膜组织按Trizol法进行总RNA提取。取少量总RNA用微量核酸蛋白检测仪测定并读取RNA浓足、度。参照反转录试剂盒(TAKARA公司,RR047A)

       

            说明书进行基因组DNA去除和cDNA合成后进行PCR半定量测定。以GAPDH为内参照基因进行对先  比。IL1RI引物序列(NM_000877.3):上游引物 5- GGGACTTTACACAGGGACCACAG:  下游弓物5-TGTTTAGATGAAGGTGACCGTCG:反应参数: 95 C5min95 C30s-55 C30s-72 C30s(33loop)72 C 5min4 C pause,产物96 bpGAPDH引物序列(NM _002046.5):上游引物5'-'GGCATCCTGGGCTACACTGAG:下游引物5'-'AGGTCCACCACCCTGTTGC;反应参数: 95C7 min95 C 30s55 C 30s-72 C 30s (33loop)72 C 7 min4 C pause,产物166 bp。取10 μL反应产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳后在UVP凝胶扫描成像分析系统下拍照分析。

       

            1.5.2 IL1R I蛋白表达的检测(1)蛋白印迹法:将保存在-80 C的关节炎滑膜组织取出加入含适当比例苯甲基磺酰氟( PMSF )的蛋白裂解液在液氮中研磨,边研磨边加液氮,每隔10min研磨1次,裂解30min后将匀浆移入1.5mLEP管内离心(12000r/min,5min),取上清分装。根据BCA试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司,P1511 )操作说明绘制蛋白标准曲线并测量和计算各组蛋白浓度,以50 μg总蛋白定量,加蛋白上样缓冲液沸水煮5 min后进行SDS-PAGE电泳,转膜,5%脱脂牛奶封闭1 h, -( Abcam公司,ab106278, 1 : 1O00TBST配制)孵育(37 C孵育30 min后室温孵育3h30min),二抗(谷歌生物,GB233031:3000TBST配制)孵育(37C孵育25min后室温孵育25min),然后加显影液在凝胶成像系统下拍照并进行灰度分析。(2) 免疫组化法:PF中固定的滑膜组织用自动脱水仪进行梯度脱水、透明和浸蜡,然后包埋、切片并烤片待检。将石蜡切片预热后依次进行脱水、抗原修复、消除内源性过氧化物酶、封闭、一抗( Abcam公司,ab106737, 1 : 100PBS配制)4 C孵育过夜、二抗(谷歌生物,GB23303,1;300PBS配制)37C孵育30min、二氨基联苯胺(DAB )显色、苏木精染核、盐酸酒精分色、中性树脂封片、显微镜下取图并做平均积分光密度( AIOD )分析。

       

            1.5.3 CXCL13 mRNA表达的检测CXCL 13引物序列(NM 006419.2):上游引物5' -3' CAG CAGCCTCTCTCCAGTCC;下游引物5'-'GACAAC- CATTCCCACGGG产物139 bp.反应参数及其余操作步骤与1.5.2GAPDH基因表达的检测相同。

       

            1,5.4 CXCL13蛋白表达的检测蛋白印迹法中除抗为CXCL13抗体(R&D Systems 公司,BAS0314091,1 :1 000 TBST配制),二抗为兔抗羊抗体(武汉科瑞生物技术有限公司,111004, 1 ; 10 000TBST配制),其余条件与1.5.1L1R |蛋白表达的检测相同。兔疫组化法中除一抗为CXCL13抗体(R&D Systems公司,BAS0314091,1 : 100 PBS配制),二抗为兔抗羊抗体(武汉科瑞生物技术有限公司,111004, 1 : 5 PBS配制)其余条件与1.5.1IL1R |蛋白表达的检测相同。

      1.5.5 IL24 mRNA表达的检测IL24引物序列( NM_ _006850.3) :上游引物5'- 'TGT TCTCATCGTG

      TCACAACT GC ;下游  引  物5'-3'CCAACTGTT TGAATGCTCTCCG;产物109 bp。反应参数及其余操作步骤与1.5.2GAPDH基因表达的检测相同。

      1.5.6 IL24蛋白表达的检测IL 24抗体( SantaCruzBiotechnology公司,1 : 1000 TBST配制(WB)1 : 100PBS配制(IHC) ),其余条件与1.5.1IL1R I蛋白表达的检测相同。

      1.6统计学方法经SPSS 18.0软件分析处理,计量资料用均数+标准差表示,计量资料采用完全随机设计的方差分析,并用LSD法做多样本均数间的两两比较,方差不齐时先进行变量转换,P < 0.05为差异有统计学意义。

       

            2结果

       

            2.1 IL1R 1CXCL13 mRNAIL24 mRNA相对表达量IL1R |反转录PCR产物电泳条带灰度分3析所得数据方差齐(F=3.985P = 0.117 )  ,两组

       

            IL1R I mRNA表达量治疗后较治疗前明显降低,A组降5低较B组更显著(1),差异有统计学意义(P= 0.000).分  结果与其蛋白表达检测结果一致。 CXCL13反转录PCR兑  产物电泳条带灰度分析所得数据方差齐(F = 1.303, P=金。0.339) ,两组CXCL13mRNA表达量治疗后较治疗前明

       

            显升高,A组升高较B组更显著(2),差异有统计学意义(P= 0.000)。反转录PCR产物电泳条带显示L243mRNA 表达量治疗后较治疗前则明显升高(7),结安果与其蛋白表达检测结果一致。治疗后臭氧联合关节镜组

       

            IL 24 mRNA相对表达量较单纯关节镜组增高更显著,灰度分析数据方差齐(F = 1.419P= 0.307),提示治疗后IL24 mRNA相对表达量升高水平在两组之间比较差异有统计学意义(P= 0.030 )

       

            2.2 IL1R |CXCL13 mRNAIL24 mRNA蛋白相对表达量IL1R |蛋白电泳条带灰度分析所得数据方差齐(F=0.388P= 0.567),两组蛋白表达量治疗后较治疗前有明显降低,A组术后降低较B组更显著(3)差异有统计学意义(P =0.002) ; CXCL13蛋白电泳条带灰度分析所得数据方差齐(F = 0.554, P= 0.660),网组蛋白表达量治疗后较治疗前有明显升高,A组术后增高较B组更显著(4),差异有统计学意义(P= 0000IL1R 1免疫组化AIOD所得数据方差齐(F = 1.689,

       

       

       

      量治疗后较治疗前有明显升高,A组术后升高较B组更显著(7),差异有统计学意义(P=0.000); A组术后IL24蛋白表达量增高较B组更显著(5),平均积分光密度分析结果两组方差齐(F =0.665P=0.597),检验结果显示治疗后两组之间升高水平差异有统计学意义(P= 0.001)

       

      3讨论

       

            3.1 IL1 R |在骨关节炎中的作用及意义白细胞介素1 (interleukin 1, IL1)是高度活性和多功能的细胞因子,在许多炎性疾病病程中起关键作用。IL1与炎性细胞膜表面高表达的受体结合后通过cAMPGTP等第二信使途径干扰细胞正常代谢活动。IL1a IL1 R I黏附力较强,几乎为不可逆结合。有研究表明L1 R |与关节炎密切相关61本研究中OA患者滑膜IL1R I 检测结果提示骨关节炎患者滑膜IL1R |蛋白及基因高表达在滑膜炎症中发挥重要作用,经臭氧治疗后其表达水平明显降低,对比差异有显著性,表明臭氧可明显抑制IL1R |表达,通过降低NF-KB途径所诱导的iNOS表达来降低致炎性细胞因子NO表达,促进软骨细胞增殖,促进蛋白多糖和胶原合成,减少软骨细胞凋亡,减轻关节炎症状,延缓滑膜炎的进展。

       

            3.2CXCL13在骨关节炎中的作用及意义根据报道[5] CXCL13参与关节炎的机制可能为CXCL13低表达致使其受体的抗体核因子xB受体激活因子配体( RANKL )分泌减少,降低骨溶解和骨吸收速率,并***终导致关节内大量骨质增生,本研究中CxCL 13的表达水平与关节炎病变程度基本保持负相关支持这一结果。本研究结果显示治疗后两组患者关节滑膜CXCL 13表达量轿治疗部去R在骨关节炎中的抗炎机制可能与IL10相似,通过刺激I型胶原蛋白和蛋白多糖的表达,抑制MMPIL6 NO的表达阻断致炎性信号传导通路而阻止骨关节炎的病程进展。

       

            本研究结果虽然表明IL1R |CXCL13IL24与骨关节炎之间有密切联系,但其表达含量变化与不同阶段骨关节炎之间的关联机制仍需进一步 研究,另外本研究样本数量较小,不能代表本地区所有骨关节炎的病例。我们发现部分患者关节滑膜IL 24表达量治疗后较治疗前并无明显升高,还发现部分患者关节滑膜IL1R |表达量治疗后较治疗前并无明显降低,同时CXCL 13表达量治疗后较治疗前无明显回升,主要为男性患者,推测可能与其在康复训练中过早负重和男性患者活动量较女性患者更多诱发新的炎症有关,亦有相关研究报道类似结果[8-10],有待进一步研究。

       

      4参考文献

       

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            注治疗膝骨性关节炎的临床疗效观察[J] .实用医学杂志,201329 (24) : 4017-4019.

       

      05. XU QCHEN BWANG Y, et al. The Effectiveness

       

            of Manu- -al Therapy for Relieving Pain, Stiffness, andDysfunction in Knee Osteoarthritis: A SystematicReview and Meta- Analysis [J] . Pain Physician, 201720(4) : 229-243.

       

      06. WANG XXIA S, FU B. RNAseq analysis of synovial

       

            fibro-blasts in human rheumatoid arthritis [J]. Mol MeaRep, 201410(1) : 241-247.

       

      07.任红革.趋化因子13在膝关节骨性关节炎滑膜中的表达研元

       

            [J] .中国修复重建外科杂志,201529 (1)  39-42.08. GREISEN S R, SCHELDE K KRASMUSSENT

       

            K, et al. CX-CL13 predicts disease activity in eanerheumatoid arthritis and could be an indicator oRestherapeutic 'window of opportunity [J]Arthris ResTher, 2014, 16(5) : 434.  uiah

       

       


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